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BMC Medicine volumen 21, número de artículo: 330 (2023) Citar este artículo

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El linfoma de células T o asesinas naturales (NKTCL) es un linfoma agresivo con mal pronóstico. La terapia con células T transducidas con receptores de antígenos quiméricos (CAR-T) se ha convertido en una estrategia inmunoterapéutica prometedora contra las neoplasias malignas hematológicas.

En este estudio, se generaron cuatro líneas celulares CAR-T (CD38-CAR, LMP1-CAR, CD38-LMP1 tandem CAR 1 y CD38-LMP1 tandem CAR 2). El efecto de las células CAR-T contra las células NKTCL se evaluó tanto in vitro como in vivo. La expresión de marcadores de activación de células T y citoquinas producidas por células CAR-T se detectó mediante citometría de flujo.

Las cuatro líneas celulares CAR-T podrían eliminar eficazmente las células NKTCL malignas. Podrían activarse y producir citocinas inflamatorias de forma dependiente del objetivo. Las pruebas in vivo mostraron que las células CAR-T exhibieron efectos antitumorales significativos en un modelo de ratón NKTCL xenotrasplantado.

En resumen, cuatro líneas celulares CAR-T mostraron una citotoxicidad significativa contra las células NKTCL tanto in vitro como in vivo. Estos resultados indicaron la promesa terapéutica eficaz de las células CAR-T CD38 y LMP1 en NKTCL.

Informes de revisión por pares

NKTCL es un linfoma agresivo asociado con la infección por el virus de Epstein-Barr (VEB) que ocurre predominantemente en Asia y América del Sur [1,2,3]. NKTCL afecta principalmente sitios extraganglionares y se presenta con síntomas localizados, como obstrucción nasal y epistaxis, en la etapa temprana. Esta enfermedad puede diseminarse a múltiples sitios y causar síntomas generales, que incluyen fiebre, pérdida de peso e incluso linfohistiocitosis hemofagocítica [4,5,6,7]. Todos los tipos de NKTCL comparten la característica definitoria de la infección por EBV. Por lo tanto, un resultado positivo de infección por EBV es esencial para el diagnóstico de NKTCL [8]. La quimioterapia combinada con radioterapia es el tratamiento más común para el NKTCL en estadio limitado, con una supervivencia general (SG) a 5 años de 72 a 74 %. Para los pacientes con NKTCL en estadio avanzado, la quimioterapia sistémica sigue siendo el tratamiento primario. El régimen de dexametasona, metotrexato, ifosfamida, l-asparaginasa y etopósido (SMILE) logró una SG prolongada y una supervivencia libre de progresión (SSP) en comparación con el régimen convencional de ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovina y prednisona (CHOP) [9]. En 2011, se desarrolló el nuevo régimen de quimioterapia con dexametasona, cisplatino, gemcitabina y pegaspargasa (DDGP) y mostró resultados prometedores en pacientes con NKTCL [10].

La inmunoterapia para NKTCL se ha desarrollado lentamente. Los estudios han demostrado que los anticuerpos anti-CD30 y anti-PD1 pueden ser agentes terapéuticos eficaces para el NKTCL en recaída/refractario [11]. En la última década, una inmunoterapia prometedora y específica, la terapia con células CAR-T, ha llamado la atención de los oncólogos. CAR es un tipo de receptor sintético que fusiona un dominio de reconocimiento de antígeno con dominios de señalización de células T. Las células T cargadas con un CAR pueden reconocer moléculas diana de manera independiente de HLA [12, 13]. Las células CAR-T dirigidas a CD19 son actualmente la terapia con células CAR-T más exitosa, que han demostrado eficacia y especificidad inmunológica en el tratamiento de linfomas y se han aplicado en la administración clínica de neoplasias malignas de células B [12, 14].

CD38 participa en la patogénesis y el resultado de la infección por el virus de la inmunodeficiencia humana y la leucemia linfocítica crónica [15]. Los estudios han demostrado la eficacia de los tratamientos dirigidos a las moléculas CD38 en el mieloma múltiple [16]. La proteína de membrana latente 1 (LMP1) está codificada por EBV. Se ha demostrado que LMP1 puede inducir transformación maligna en células B y células epiteliales [17]. Estos resultados sugieren el potencial clínico de las terapias dirigidas a CD38 y LMP1 en neoplasias malignas CD38+ o LMP1+.

En este estudio, exploramos primero la viabilidad de la terapia con células CAR-T dirigida tanto a CD38 como a LMP1. Se construyeron cuatro líneas celulares CAR-T (CD38-CAR, LMP1-CAR, CD38-LMP1 tandem CAR 1 y CD38-LMP1 tandem CAR 2) y se evaluaron sus efectos antitumorales tanto in vitro como in vivo.

Las líneas celulares utilizadas en este estudio, NKYS, YT y KAI3, se obtuvieron del Dr. Wing C. Chan (City of Hope Medical Center, Los Ángeles, EE. UU.). El Dr. Norio Shimizu y Yu Zhang de la Universidad de Chiba proporcionaron células SNK6. Las células SNT16 fueron un regalo de Guangzhou Bairui Biomedical Technology Company, Ltd. Las células NKYS, YT, KAI3 y SNT16 se cultivaron en medio RPMI-1640 suplementado con FBS al 10 % (Gibco, EE. UU.) y antibióticos (penicilina 100 U/ml, 100 µg /ml de estreptomicina). Se añadió IL-2 adicional (100 UI/ml) al medio para células NKYS y KAI3. Las células SNK6 se cultivaron en medio RPMI-1640 con reemplazo de suero de células inmunitarias al 10 % (Gibco, EE. UU.), IL-2 (200 UI/ml) y antibióticos. Todas las células se cultivaron en una incubadora (Thermo Fisher, EE. UU.) a 37 °C y 5% de CO2. Todas las líneas celulares dieron negativo en cuanto a contaminación por micoplasma y los marcadores de la superficie celular de estas líneas celulares se validaron mediante citometría de flujo.

Las células se lisaron en tampón de lisis NP40 y luego se centrifugaron para recolectar el sobrenadante de proteína. Se resolvieron veinte microgramos de proteínas mediante SDS‒PAGE y se transfirieron a las membranas de fluoruro de polivinilideno (Amersham Biosciences, EE. UU.). Las membranas se bloquearon en tampón Tween salino tamponado con Tris que contenía leche desnatada al 5 % (p/v) a temperatura ambiente durante 1 h y luego se incubaron con anticuerpos primarios, incluidos anti-LMP1 (Abcam, ab78113) y anti-GAPDH (ProteinTech , 60.004–1-lg) a 4 °C durante la noche y luego con anticuerpos secundarios durante 1 h a temperatura ambiente. Las imágenes de las bandas se capturaron digitalmente con un sistema ChemiDocTM XRC+ (Bio-Rad Laboratories, EE. UU.).

Las células NKYS, YT, KAI3, SNK6 y SNT16 se fijaron en formalina y se bloquearon en solución tampón fosfato (PBS) con suero de cabra al 5% y Triton X-100 al 0,1%. Luego, las células se incubaron durante la noche a 4 °C con un anticuerpo anti-LMP1 (Abcam, ab78113). Después de lavar 3 veces con PBS, las células se incubaron con un anticuerpo secundario de cabra anti-ratón marcado con Cy3 y DAPI. Después de lavar con PBS, las células se analizaron bajo un microscopio de fluorescencia (Nikon, Japón) con un aumento de × 40.

Los tejidos tumorales de pacientes con NKTCL o ratones portadores de tumores se fijaron en formalina, se descalcificaron y se incluyeron en parafina. Después de la recuperación del antígeno, las secciones se bloquearon con H2O2 al 0,3% en metanol. Las secciones se hirvieron durante 10 minutos en tampón citrato y se bloquearon con un bloque de proteína libre de suero. Luego, los portaobjetos se incubaron con anticuerpos primarios anti-CD38 (Servicebio, GB114831), anti-LMP1 (Abcam, ab78113), anti-CD3ε (Servicebio, GB13014) o anti-CD56 (Servicebio, GB12041) y peroxidasa de rábano picante (HRP). anticuerpo secundario marcado. Para la hibridación in situ del ARN codificado por EBV (EBER), las secciones se trataron con enzimas gástricas y se deshidrataron con alcohol después de la desparafinación. Luego, las secciones se incubaron con sonda EBER y anticuerpo antidigoxina marcado con HRP. Después de la incubación con anticuerpos marcados con HRP, las secciones se lavaron tres veces con PBS y se tiñeron con una solución reveladora de color DAB. Luego, las secciones se tiñeron con hematoxilina, se deshidrataron mediante una serie graduada de alcohol, se aclararon con xileno y se cubrieron con cubreobjetos. El porcentaje de células positivas se calificó de la siguiente manera: 0, expresión negativa (la frecuencia de células positivas fue inferior al 5%); 1, expresión débilmente positiva (la frecuencia de células positivas fue del 5% ~ <25%); 2, expresión positiva (la frecuencia de células positivas osciló entre 25 y <50%); y 3, expresión fuertemente positiva (la frecuencia de células positivas fue ≥ 50%).

Las secuencias CAR incluían los dominios del fragmento genético de la región variable del anticuerpo monocatenario (scFv) de los anticuerpos específicos de CD38 y/o LMP1, un dominio transmembrana CD8a, un dominio coestimulador 4-1BB y un motivo CD3ζ. Las secuencias CAR se produjeron sintéticamente (GENEWIZ, Suzhou, China) y se clonaron en el vector pEF-MCS-P2A-EGFP. Entre estos, la secuencia LMP1-CAR se clonó y fusionó con o sin EGFP. Las secuencias CD38-CAR y dos Tan-CAR no se fusionaron con EGFP.

Se cultivaron 293 células T en medio DMEM suplementado con FBS al 10% y antibióticos. Luego, los vectores pRSV-Rev, pLP-VSVG, pCMV-Gag-Pol y las construcciones CAR (o vector) se transfectaron en células T 293 utilizando reactivo de transfección PEI (Sigma, EE. UU.). Setenta y dos horas después de la transfección, se recogieron y concentraron los sobrenadantes libres de células utilizando un dispositivo de ultrafiltración (Merck Millipore, EE. UU.).

Se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de la sangre periférica de donantes sanos mediante centrifugación de densidad Ficoll-Paque. Luego, se aislaron células T de PBMC usando separación celular magnética (MACS) y CD3 Dynabeads (Miltenyi Biotec, Alemania) y se cultivaron en medio X VIVO-15 (LONZA, Suiza) suplementado con 200 UI/ml de IL-2 y CD3/28. Dynabeads (Gibco, EE. UU.).

Las células T se transdujeron mediante incubación con un lentivirus CAR (CAR-T) o un lentivirus vector (Control T). Después de una centrifugación inmediata durante 90 minutos a 37 °C, las células transducidas se cultivaron a 37 °C y 5% de CO2 durante 48 h. Se utilizó el vector de fusión LMP1-CAR-EGFP para la detección de la eficiencia de la transfección y el ensayo de citotoxicidad in vitro. Se utilizó el vector LMP1-CAR sin EGFP para la detección de marcadores de activación de células T, producción de citoquinas y experimentos in vivo. La eficiencia de transfección de CD38-CAR o dos células Tan CAR-T se detectó mediante un clasificador de células activadas por fluorescencia (FACS) utilizando proteína CD38 humana recombinante marcada con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (ACROBiosystems, China).

Se co-incubaron diluciones en serie de células CAR-T o de control (efectoras) con líneas celulares NKTCL (objetivo) en proporciones E:T (efector-objetivo) de 4:1, 2:1, 1:1 y 1. :2 durante 6h. La citotoxicidad de las células CAR-T se determinó midiendo la liberación de lactato deshidrogenasa (LDH) por parte de las células tumorales deterioradas. La LDH en el sobrenadante se detectó con un kit de ensayo de citotoxicidad no radiactiva CytoTox 96® (Promega, EE. UU.).

Para evaluar la citotoxicidad de las células T en una proporción E:T más baja, las líneas celulares NKTCL se marcaron con diacetato de carboxifluoresceína y éster de succinimidilo (CFSE) y luego se incubaron conjuntamente con células CAR-T o T de control en una proporción E:T de 1. :2 durante 18h. Luego, las células se tiñeron con anexina V y PI (Keygen Biotech, Jiangsu, China) y se analizaron en un citómetro de flujo FACSCalibur.

Las células CAR-T o las células T de control se incubaron con líneas celulares NKTCL (grupo de tratamiento) en una proporción de 1:10 o con medio (grupo en blanco) durante 24 h antes de detectar los biomarcadores de activación de las células T. Luego, se identificaron diferentes subconjuntos de células T utilizando anticuerpos conjugados con fluoresceína específicos para CD4, CD8, CD25, CD69, CD38 y HLA-DR humanos (BD Bioscience, EE. UU.).

Se utilizó una matriz de perlas citométricas (CBA) para detectar las citocinas inflamatorias y la granzima B en el sobrenadante de células. En resumen, se cocultivaron 2 × 104 células CAR-T o T de control con 2 × 105 células NKTCL diana (grupo de tratamiento) o medio (grupo en blanco) en un volumen de 200 μl durante 24 h. Luego, se incubaron 50 μl de sobrenadante celular o diluciones estándar de citocinas con diferentes concentraciones con perlas de captura específicas que reconocen IL-2, IL-5, IL-6, IL-13, factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), granzima B, interferón (IFN) -γ y factor de necrosis tumoral (TNF) -α y anticuerpos de detección marcados con ficoeritrina (PE) (BD Bioscience, EE. UU.) durante 2 h. Se lavaron las perlas y se analizó la intensidad de fluorescencia de las perlas de captura mediante un ensayo de citometría de flujo estandarizado. La curva estándar se calculó según la intensidad de fluorescencia promedio de las diluciones estándar. Luego, se calculó la concentración de citoquinas en el sobrenadante celular según la curva estándar.

Los ratones NSG (3 a 4 semanas de edad, hembras, 15 a 20 g) utilizados en este estudio se obtuvieron del Centro de Organismos Modelo de Shanghai (Shanghai, China). Se mezclaron un total de 5 × 106 células NKYS-luciferasa con Matrigel isopícnico (Corning Incorporated, EE. UU.) y se implantaron por vía subcutánea en ratones. Los ratones en los grupos de tratamiento (n = 6 por grupo) recibieron una inyección intravenosa en la vena de la cola de 4 células CAR-T o células T de control los días 15 y 18 después de la implantación del tumor, con un total de 1 × 107 células T infundidas por ratón ( aproximadamente 4 × 106 células transducidas). Los ratones del grupo en blanco no fueron tratados. El tamaño del tumor se midió con un pie de rey cada 3 días durante los primeros 50 días después de la implantación y diariamente después de 50 días. Los ratones recibieron D-luciferina (150 mg/kg, ip) y se anestesiaron con isoflurano. Después de 5 minutos, se detectó luminiscencia utilizando un sistema de imágenes in vivo (IVIS) y la intensidad se cuantificó y normalizó con el software Living Image (PerkinElmer, MA, EE. UU.). Se consideró un evento final un tamaño de tumor de 1000 mm3 o la muerte de un ratón. Después de 75 días, los ratones fueron sacrificados mediante dislocación cervical.

El análisis estadístico se realizó con GraphPad Prism versión 5.0 (GraphPad Software, Inc., La Jolla, CA, EE. UU.). Los resultados se informan como media ± desviación estándar o mediana y rango intercuartil para mediciones repetidas. Se aplicó el análisis de varianza (ANOVA) seguido de la prueba posterior de Bonferroni para evaluar las diferencias entre muestras distribuidas normalmente, y la prueba de Mann-Whitney se utilizó para muestras no distribuidas normalmente. Un valor de P < 0,05 se consideró estadísticamente significativo.

Se evaluó la expresión de CD38 y LMP1 en tejidos tumorales de 10 pacientes con NKTCL (Fig. 1a, archivo adicional 1: Fig. S1). Un total de 7/10 pacientes fueron positivos para CD38 (puntuación superior a 1) y 5/10 pacientes fueron positivos para LMP1 (puntuación superior a 1) (Tabla 1).

Expresión de CD38 y LMP1 en pacientes y líneas celulares de NKTCL. una expresión de CD38 y LMP1 en pacientes con NKTCL. Las flechas mostraron las células positivas. Barra de escala: 10 μm. b Expresión de CD38 en líneas celulares NKTCL detectada por FACS. c Expresión de LMP1 en líneas celulares NKTCL detectada por inmunofluorescencia. La fluorescencia roja mostró las células positivas. d Expresión de LMP1 en líneas celulares NKTCL detectada mediante transferencia Western. e Secuencias de fragmentos de cuatro CAR y construcciones de dos Tan CAR

Las líneas celulares NKTCL NKYS, YT, KAI3, SNK6 y SNT16 se utilizaron como células diana en este estudio. La detección por FACS mostró una expresión homogénea de CD38 en células NKYS, YT y KAI3 y una expresión negativa en células SNK6 y SNT16 (Fig. 1b). Los análisis de inmunofluorescencia y transferencia Western mostraron una expresión positiva de LMP1 en células NKYS, KAI3 y SNK6 (Fig. 1c, d). Las 5 líneas celulares diana podrían dividirse en cuatro grupos: células CD38 + LMP1 + (NKYS y KAI3), células CD38 + LMP1 − (YT), células LMP1 + CD38 − (SNK6) y células CD38-LMP1 − (SNT16).

Las secuencias de scFv anti-CD38 y anti-LMP1 se basaron en secuencias de anticuerpos específicas de CD38 y LMP1 publicadas [18, 19]. Dos CAR de un solo objetivo (CD38-CAR y LMP1-CAR) contenían el dominio scFv correspondiente, mientras que dos CAR en tándem (Tan CAR 1 y Tan CAR 2) contenían ambos dominios scFv en diferentes órdenes conectados a través de un conector G4S (Fig. 1e). . El CD38-CAR o dos células Tan CAR-T podrían marcarse con la proteína CD38 humana recombinante y detectarse mediante FACS, lo que sugirió la afinidad de unión a la proteína CD38 de las células CAR-T. La afinidad de LMP1-CAR y dos células Tan CAR-T por la proteína LMP1 se demostró por sus diferentes efectos sobre las células tumorales LMP1 + o LMP1 - en experimentos posteriores in vitro e in vivo (archivo adicional 1: Fig. S2).

Se detectó LDH liberada por células tumorales lisadas para evaluar la citotoxicidad de las células CAR-T. En comparación con las células T de control, las células CD38-CAR y LMP1-CAR-T mostraron una citotoxicidad significativamente mayor hacia las células diana CD38+ (NKYS, YT y KAI3) y las células diana LMP1+ (NKYS, KAI3 y SNK6), respectivamente, en un E :T relación de 4:1. Sin embargo, no hubo diferencias en las células CD38 - (SNK6 y SNT16) o LMP1 - (YT y SNT16). Las células T Tan CAR 1 y Tan CAR 2 lisaron eficazmente tanto las células diana CD38+ como las LMP1+ (NKYS, YT, KAI3 y SNK6). Sin embargo, no mostraron citotoxicidad aparente hacia las células CD38-LMP1 − (SNT16). La respuesta de las células T de control a todas las células NKTCL diana fue limitada. También analizamos la actividad citolítica de las células Tan CAR-T y de un solo objetivo. Las dos células Tan CAR T mostraron una citotoxicidad significativamente mayor para las células CD38 + LMP1 + (NKYS y KAI3) que las células CD38-CAR y LMP1-CAR-T (Fig. 2a).

Citotoxicidad de las células CAR-T. Se co-incubaron células CAR-T o T de control con líneas celulares NKTCL durante 6 h. El efecto citotóxico de las células T CD38-CAR-T y de control se evaluó detectando la LDH liberada por las células tumorales. b Se incubaron conjuntamente células CAR-T o T de control con líneas celulares NKTCL marcadas con CFSE durante 18 h. Las células se tiñeron con anexina V y PI para evaluar la citotoxicidad de las células T. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05. ns, no significativo; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001

Para la determinación del efecto antitumoral a una relación E:T más baja, se incubaron conjuntamente células CAR-T con líneas celulares NKTCL marcadas con CFSE durante 18 h. Con una proporción E:T de 1:2, las células CAR-T mostraron una citotoxicidad significativa contra las células NKTCL positivas al objetivo (Fig. 2b, c). De manera similar a los resultados anteriores, las 2 células Tan CAR-T mostraron una citotoxicidad significativamente mayor para las células CD38 + LMP1 + que 2 células CAR-T de un solo objetivo (Fig. 2b, c).

La estimulación de las células T puede conducir a la regulación positiva de los marcadores de activación celular de superficie, incluidos los marcadores de activación temprana (CD69) y tardía (CD25 y HLA-DR) [20]. Para evaluar la activación de las células T dependiente del objetivo, se cultivaron conjuntamente células T de control y CAR-T con las 5 líneas celulares NKTCL objetivo durante 24 h. Los datos mostraron que la incubación conjunta con células NKTCL con diana positiva podría aumentar significativamente la expresión de CD25 y HLA-DR en los subgrupos CD4+ y CD8+ de células CAR-T (Fig. 3a, b, archivo adicional 1: Figs. .T3-T4).

Activación y liberación de citocinas de células CAR-T cocultivadas con NKYS. a FACS detectó la expresión de marcadores de activación (CD69, CD25 y HLA-DR) en los subgrupos de células T CD4+ y CD8+. b Resultados estadísticos de la expresión de marcadores de activación en células T. ΔPorcentaje es igual a la diferencia entre la proporción de subpoblación positiva de células T en el grupo de tratamiento y el grupo en blanco. c Las citocinas liberadas por las células CAR-T y las células T de control se detectaron utilizando el kit CBA. Δpg/ml se refiere a la diferencia entre la concentración de citoquinas en los grupos de tratamiento y en blanco. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05. ns, no significativo; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001

Se detectaron citocinas inflamatorias y granzima B liberadas por las células T. Después de 24 h de cocultivo de las 4 células CAR-T o células T de control con células NKTCL diana, se recogió el sobrenadante celular y se midieron las concentraciones de IL-2, IL-5, IL-6, IL-13, GM- El LCR, la granzima B, el IFN-γ y el TNF-α se midieron mediante citometría de flujo. Los datos mostraron que las 4 líneas celulares CAR-T estimuladas por células NKTCL positivas generaron niveles significativamente mayores de estas citocinas en comparación con las células T de control (Fig. 3c, archivo adicional 1: Fig. S5-S6). Cuando se cultivaron conjuntamente con células CD38 + LMP1 + NKYS, las dos líneas celulares Tan CAR-T produjeron más IL-5, IL-6, IL-13, granzima B, IFN-γ y TNF-α que LMP1-CAR-T. células. También se observaron resultados similares para la otra línea celular CD38+ LMP1+, KAI3.

Los estudios in vitro demostraron que las 4 líneas de células CAR-T exhibieron efectos antitumorales válidos en comparación con las células T de control. Por lo tanto, investigamos más a fondo la eficacia de las células CAR-T contra las células NKTCL in vivo en un modelo de ratón NSG con xenoinjerto tumoral NKYS subcutáneo. La carga tumoral se controló midiendo la intensidad de la luminiscencia utilizando IVIS. Doce días después de la implantación de células tumorales, los ratones fueron tratados con una inyección intravenosa de células T o CAR-T de control (Fig. 4a). Los tumores mostraron una progresión rápida en el grupo no tratado y en el grupo tratado con células T de control (Fig. 4b). El tratamiento con células CAR-T indujo un efecto antitumoral significativo (Fig. 4c). Los datos también mostraron cargas tumorales más pequeñas en los dos grupos de ratones tratados con células Tan CAR-T en comparación con los tratados con células CAR T de un solo objetivo, pero no hubo diferencias significativas entre los dos grupos tratados con células Tan CAR-T (Fig. .4d). La terapia con células CAR-T condujo a una ventaja de supervivencia significativa en comparación con los grupos en blanco y de control (archivo adicional 1: Fig. S7). Los tumores aislados de ratones se tiñeron positivamente para CD3ε, CD56 y EBER mediante inmunohistoquímica (Fig. 4e).

Efectividad de las células CAR-T sobre NKTCL in vivo. a Descripción general del tratamiento del modelo tumoral de xenoinjerto in vivo. b, c El crecimiento del tumor se controló mediante imágenes vivas IVIS. La carga tumoral del ratón se indicó mediante radiación de bioluminiscencia. d Las células Tan CAR-T mostraron un efecto antitumoral significativo en comparación con las células CD38 o LMP1-CAR-T. La IHC mostró que los tumores aislados de ratones eran positivos para CD3ε, CD56 y EBER. Las flechas mostraron las células positivas. Barra de escala: 10 μm. Se consideró estadísticamente significativo un valor de p < 0,05. ns, no significativo; *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001

En la última década, la terapia con células CAR-T ha demostrado un enorme potencial en el tratamiento de la leucemia y el linfoma de células B [21, 22]. Nuestro estudio anterior demostró que la administración de células CAR-T es una estrategia inmunoterapéutica prometedora para la leucemia/linfoma linfoblástico T [23]. Hasta la fecha, los estudios sobre la terapia con células CAR-T para NKTCL son limitados. Las células CAR-T dirigidas a CD38 y B7-H3 se han evaluado como dos agentes inmunoterapéuticos para la terapia con NKTCL [24, 25].

CD38 es una glicoproteína transmembrana de tipo II expresada en una variedad de células inmunes, incluidas células T, células B, células NK, macrófagos y células dendríticas [26]. CD38 se ha desarrollado como un objetivo prometedor para el tratamiento de tumores malignos. Un ensayo clínico (NCT02927925) demostró que daratumumab, un anticuerpo monoclonal anti-CD38, logró una tasa de respuesta global (TRO) del 25,0 % en el tratamiento del NKTCL recidivante o refractario [27]. Los investigadores también han evaluado la viabilidad de la terapia con células CD38-CAR-T en una variedad de neoplasias linfoides, incluido el mieloma múltiple y NKTCL [18, 21, 25].

El VEB se observa en casi todas las células tumorales NKTCL [28]. LMP1 es una proteína transmembrana integral codificada por EBV y puede estar relacionada con un aumento de neoplasias malignas y una disminución de la respuesta inmune [29]. LMP1 puede inducir transformación maligna en células B y células epiteliales al inducir moléculas de adhesión a la superficie celular, activar antígenos y regular positivamente proteínas antiapoptóticas [17, 30, 31, 32].

En este estudio, evaluamos la expresión de CD38 y LMP1 en pacientes con NKTCL. Los datos mostraron que CD38 se expresaba altamente (7/10 positivos) en tejidos tumorales NKTCL. Aunque LMP1 fue positiva sólo en 5/10 pacientes con NKTCL, su papel en la transformación maligna y la respuesta inmune la convirtieron en una molécula no despreciable. Estos resultados indicaron que estas proteínas podrían ser objetivos potenciales para la inmunoterapia en NKTCL. Construimos dos CAR de un solo objetivo, CD38-CAR y LMP1-CAR. Ambas líneas celulares CAR-T podrían activarse y liberar mayores cantidades de citocinas cuando se incuban con células NKTCL positivas para CD38 o LMP1. Cuando se cultivaron conjuntamente con líneas celulares NKTCL, las células CAR-T mostraron una mayor expresión de marcadores de activación tardía de células T (CD25 y HLA-DR) tanto en los subgrupos CD4+ como en CD8+. Cuando son activadas por antígenos diana, las células CAR-T pueden liberar citoquinas y lisar células tumorales [33]. En nuestro estudio, las células CAR-T estimuladas por células NKTCL generaron niveles relativamente altos de IL-2, IL-5, IL-6, IL-13, GM-CSF, granzima B, IFN-γ y TNF-α. La producción de IL-2, IL-6 e IFN-γ mostró los mayores cambios. IL-2 promueve la proliferación de inmunocitos y la transcripción de proteínas antiapoptóticas [34]. El IFN-γ participa en efectos antiproliferativos, antiangiogénicos y proapoptóticos contra células malignas [35]. La IL-6 participa en la inflamación autoinmune crónica y puede inducir una tormenta de citocinas. Se ha descubierto que el tratamiento con tocilizumab, un anticuerpo anti-receptor de IL-6, alivia la tormenta de citoquinas inducida por la terapia con células T del receptor de antígeno quimérico (CAR) [36].

Nuestros datos también mostraron una actividad citolítica significativa de las células CD38 - y LMP1-CAR-T contra las células NKTCL tanto in vitro como in vivo. En comparación con las células T de control, las células CAR-T mostraron una citotoxicidad significativamente mayor para las líneas celulares NKTCL. El ensayo de LDH y el ensayo de Anexina V indicaron que las dos células CAR-T de un solo objetivo podían eliminar las células NKTCL CD38+ o LMP1+ de forma rápida y eficiente. Sin embargo, no mostraron ningún efecto sobre las líneas celulares CD38 o LMP1. Estos resultados indican que las células CAR-T pueden reconocer las moléculas diana correspondientes y eliminar las células tumorales de forma dependiente de HLA. La citotoxicidad in vitro de las células CAR-T fue respaldada por los resultados generados con el modelo de ratón in vivo. Los tumores progresaron rápidamente en ratones que no recibieron tratamiento con células CAR-T ni recibieron infusión de células T de control. El tratamiento con células CAR-T inhibió significativamente el crecimiento tumoral.

Debido a la heterogeneidad antigénica variable en las células tumorales, las terapias con células CAR-T dirigidas a más de un antígeno son de interés para los investigadores. Un Tan CAR incluye dos dominios de unión a antígeno en una única estructura CAR. Las células Tan CAR-T son capaces de lisar las células diana tras la pérdida de una de las moléculas diana y producen un efecto de mejora sinérgico al reconocer ambos objetivos [37, 38]. Los tumores que han recaído o se han vuelto refractarios debido al escape de antígenos son uno de los desafíos más comunes en la terapia dirigida. La terapia con células Tan CAR-T específicas para dos objetivos distintos puede ser un enfoque viable para superar el escape de antígenos y ampliar las especificidades de las células CAR T. La presencia de scFv contra dos antígenos diana podría mejorar la activación de las células T y la citólisis a través de una mayor avidez [37]. Hasta la fecha, varias células Tan CAR T se han sometido a una evaluación preclínica contra líneas celulares malignas, como las células Tan CAR-T CD19-CD20, CD38-BCMA y CD70-B7-H3 [38,39,40].

Construimos dos Tan CAR. Ambas líneas celulares Tan CAR-T podrían activarse mediante células NKTCL positivas para CD38 y/o LMP1. El aumento de la liberación de citocinas también demostró la activación dependiente del objetivo de las células Tan CAR-T. Después de la estimulación con células CD38 + LMP1 + (NKYS y KAI3), las dos líneas celulares Tan CAR-T produjeron más IL-13, granzima B, IFN-γ y TNF-α que las células LMP1-CAR-T, lo que sugirió que la La producción de citocinas de las células Tan CAR-T se vio afectada principalmente por el reconocimiento de CD38. Mostraron una actividad citolítica más fuerte contra las células tumorales que las células CAR-T de un solo objetivo, tanto in vitro como in vivo. En comparación con las dos líneas celulares CAR-T de un solo objetivo, las dos líneas celulares Tan CAR-T produjeron efectos similares contra las células YT (CD38 + LMP1 -) y SNK6 (CD38-LMP1 +). Estos resultados verificaron que los Tan CAR producen un efecto de mejora sinérgico mediante el reconocimiento de ambos objetivos y la actividad citolítica hacia las células NKTCL tras la pérdida de una de las moléculas objetivo.

En este estudio, por primera vez, se utilizaron CD38 y LMP1 como objetivos inmunoterapéuticos en NKTCL. Las cuatro líneas celulares CAR-T mostraron citotoxicidad contra células NKTCL in vitro e in vivo. Estas células CAR-T pueden proporcionar una solución prometedora y eficaz para el tratamiento de los linfomas. En particular, los dos Tan CAR pueden evitar el desafío del escape del antígeno durante la inmunoterapia. Pueden proporcionar una solución prometedora y eficaz para el tratamiento de NKTCL en el futuro.

Los conjuntos de datos utilizados y analizados durante el presente estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

Análisis de variación

T transducido con receptor de antígeno quimérico

Conjunto de perlas citométricas

Diacetato de carboxifluoresceína, éster succinimidílico

Ciclofosfamida, hidroxidaunorrubicina, oncovina y prednisona

Dexametasona, cisplatino, gemcitabina y pegaspargasa

ARN codificado por EBV

Virus de Epstein Barr

Clasificador de células activado por fluorescencia

Isotiocianato de fluoresceína

Factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos

Peroxidasa de rábano picante

Interferón

Sistema de imágenes in vivo

Lactato deshidrogenasa

Proteína de membrana latente 1

Separación celular magnética

Linfoma de células T/asesinas naturales

Tasa de respuesta general

Sobrevivencia promedio

Células mononucleares de sangre periférica.

Solución tampón de fosfato

Ficoeritrina

Supervivencia libre de progresión

Fragmento del gen de la región variable del anticuerpo monocatenario

Dexametasona, metotrexato, ifosfamida, l-asparaginasa y etopósido

factor de necrosis tumoral

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No aplica.

Este trabajo fue apoyado por los fondos para grupos de investigación creativa del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Zhengzhou (QNCXTD2023012) y la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82000133; 81970184; 82170183; 82070209) y el Plan de Proyectos Clave de Investigación Científica de colegios y universidades en Provincia de Henan (21A320027).

Hongwen Li y Wenting Song contribuyeron igualmente a este trabajo.

Departamento de Oncología, Jianshendong Rd., Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Zhengzhou, No. 1, Zhengzhou, 450052, Provincia de Henan, China

Hongwen Li, Wenting Song, Jiazhuo Wu, Zhuangzhuang Shi, Yuyang Gao, Jiwei Li, Lijuan Han, Jianxiang Zhang, Zhaoming Li y Mingzhi Zhang

Laboratorio estatal clave para la prevención y el tratamiento del cáncer de esófago y laboratorio clave de Henan para la investigación del cáncer de esófago, primer hospital afiliado de la Universidad de Zhengzhou, Zhengzhou, Henan, China

Hongwen Li, Wenting Song, Jiazhuo Wu, Zhuangzhuang Shi, Yuyang Gao, Jiwei Li, Zhaoming Li y Mingzhi Zhang

Academia de Ciencias Médicas de la Universidad de Zhengzhou, Zhengzhou, Henan, China

Wenting Song, Jiazhuo Wu, Zhuangzhuang Shi y Yuyang Gao

Departamento de Medicina, Baylor College of Medicine, Houston, TX, EE. UU.

Yong Li

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Investigación diseñada por HL. HL, WS, JW, ZS, YG, JL y LH realizaron la investigación y analizaron los datos. HL, WS, JW, ZS, YG, JL y LH analizaron los datos. HL escribió el primer borrador del artículo. JZ, ZL, YL y MZ mejoraron y revisaron el artículo. MZ conceptualizó el artículo. Todos los autores leyeron y aprobaron el manuscrito final.

Correspondencia a Mingzhi Zhang.

El estudio con animales fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Zhengzhou (Lote No. 2021-KY-00586). El estudio con participantes humanos fue aprobado por el Comité de Ética de Investigación Institucional del Primer Hospital Afiliado de la Universidad de Zhengzhou (Lote No. 2021-KY-00586). De acuerdo con los principios descritos en la Declaración de Helsinki, se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los pacientes y de los donantes sanos para este estudio.

No aplica.

Los autores declaran que no tienen intereses en competencia.

Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

A: expresión de CD38 y LMP1 en pacientes con NKTCL. Figura S2. La expresión de CAR se detectó mediante la proteína CD38 humana marcada con FITC o EGFP. Figura S3. Expresión de marcadores de activación (CD69, CD25 y HLA-DR) en subgrupos CD4+ y CD8+ de células CAR-T cocultivadas con YT, KAI3, SNK6 o SNT16. Figura S4. Resultados estadísticos de la expresión de marcadores de activación en células CAR-T cocultivadas con YT, KAI3, SNK6 o SNT16. Figura S5. Resultados estadísticos de la liberación de citoquinas de células CAR-T cocultivadas con YT, KAI3, SNK6 o SNT16. Figura S6. El histograma de flujo mostró la intensidad de fluorescencia de cada citocina. Figura S7. Datos de la curva de supervivencia para cada grupo experimental.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/. La exención de dedicación de dominio público de Creative Commons (http://creativecommons.org/publicdomain/zero/1.0/) se aplica a los datos disponibles en este artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito a los datos.

Reimpresiones y permisos

Li, H., Song, W., Wu, J. et al. Las células CAR-T que se dirigen a CD38 y LMP1 exhiben una potente actividad antitumoral contra el linfoma de células NK/T. BMC Med 21, 330 (2023). https://doi.org/10.1186/s12916-023-03040-0

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Recibido: 14 de abril de 2023

Aceptado: 18 de agosto de 2023

Publicado: 30 de agosto de 2023

DOI: https://doi.org/10.1186/s12916-023-03040-0

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